分光光度計的使用

德赫機械

分光光度計是實驗室中用于定量分析物質(zhì)濃度的核心儀器，通過測量物質(zhì)對特定波長光的吸收程度（吸光度），結(jié)合朗伯-比爾定律（A=ε?c?l），可間接計算目標物質(zhì)的濃度。以下是其使用流程、關(guān)鍵步驟及注意事項的詳細說明：

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一、使用前準備

• 儀器檢查
  • 開機預(yù)熱：開啟電源后，儀器需預(yù)熱15-30分鐘（紫外可見分光光度計需預(yù)熱更久），確保光源穩(wěn)定。
  • 光源檢查：確認鎢燈（可見光區(qū)）或氘燈（紫外光區(qū)）正常點亮，無閃爍或異常噪音。
  • 波長校準：使用鈥玻璃、汞燈等標準物質(zhì)驗證波長準確性（如546.07 nm、486.13 nm等特征峰）。
    
• 試劑與樣品準備
  • 空白對照：使用與樣品相同的溶劑（如去離子水、緩沖液）作為參比溶液，消除溶劑背景吸收。
  • 樣品處理：確保樣品澄清透明，避免懸浮顆粒干擾（如需離心或過濾）。
  • 濃度范圍：根據(jù)預(yù)估濃度稀釋樣品，使吸光度落在0.2-0.8（線性范圍）之間。
    
  
  

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二、操作步驟

• 波長設(shè)置
  • 根據(jù)目標物質(zhì)的吸收峰選擇波長（如核酸在260 nm，蛋白質(zhì)在280 nm）。
  • 示例：測定DNA濃度時，設(shè)置波長為260 nm。
    
• 調(diào)零（基線校正）
  • 將空白對照溶液倒入比色皿（光程通常為1 cm），放入樣品室。
  • 調(diào)節(jié)“調(diào)零”或“Abs 0”旋鈕，使儀器顯示吸光度為0.000。
    
• 樣品測量
  • 倒出空白溶液，用待測樣品潤洗比色皿2-3次，再注入樣品。
  • 擦拭比色皿外壁水漬，放入樣品室，關(guān)閉艙門。
  • 讀取吸光度值（A）或透光率（T，T=10?A）。
    
• 數(shù)據(jù)處理
  • 單波長法：直接使用吸光度值計算濃度（c=A/(ε?l)）。
  • 雙波長法：選擇兩個波長（如260 nm和280 nm），通過差值消除雜質(zhì)干擾。
  • 標準曲線法：測定一系列已知濃度標準品的吸光度，繪制線性回歸方程，再計算未知樣品濃度。
    
  
  

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